Dòng xúc tác sinh học cho phép sản xuất peptide vòng lớn Enlicitide

Chất ức chế PCSK9 đường uống đang được nghiên cứu của MSD, enlicitide decanoate (MK-0616), là chất ức chế PCSK9 peptide vòng đa vòng đường uống đầu tiên chứng minh khả năng giảm LDL-C đáng kể ở người. Enlicitide được phát triển từ màn hình hiển thị mRNA của các peptit đơn vòng và sau đó được ổn định thông qua các liên kết chéo không phải peptit để tạo ra cấu trúc bao gồm ba vòng lớn được hợp nhất. Octapeptide phức tạp này chứa sáu axit amin không tự nhiên và hai axit amin tạo protein được kết nối bằng 12 liên kết amit và một liên kết chuỗi sáu carbon trung tâm. Quá trình tổng hợp hóa học truyền thống đòi hỏi 43 bước, thao tác với nhóm bảo vệ (gần một nửa số bước tổng hợp), tinh chế sắc ký và bước hoán chuyển đóng vòng được xúc tác ruthenium ở độ loãng cao, hạn chế khả năng mở rộng và tính bền vững.

Phát triển sản xuất hóa học

Các nhà khoa học của MSD đã phát triển một quy trình hóa học ngắn gọn và hội tụ để sản xuất enlicitide decanoate (1) được kích hoạt bằng cách ghép trực tiếp các monome bằng các dây chằng axit amin, kết hợp với việc thắt đoạn peptit xúc tác sinh học và quá trình macrocycl hóa bằng cách sử dụng este và imine reductase.

Thành tựu quan trọng

Lắp ráp tầng ba enzyme sử dụng dây chằng ATP-grasp

- Dòng ba enzyme (hai dây chằng ATP được thiết kế + tái chế ATP) lắp ráp một tetrapeptide từ các axit amin không được bảo vệ. Các dây chằng nắm ATP (cụ thể là các dây chằng axit amin phụ thuộc ATP, AAL) là các enzyme xúc tác hình thành liên kết amit giữa các axit amin hoặc peptide không được bảo vệ sử dụng ATP làm nguồn năng lượng. Cơ chế của chúng tiến hành thông qua một chất trung gian anhydrit hỗn hợp, cho phép ghép nối trực tiếp mà không cần các nhóm bảo vệ trên amin nucleophilic hoặc các chất cho acyl hoạt hóa. Trong nghiên cứu này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng ligase ATP-grasp từ Bifidobacteria adolescentis (BaAAL) và các biến thể được thiết kế (Trp-BaAALEng và Phe-BaAALEng) để mở rộng có chọn lọc một dipeptide với hai axit amin không tự nhiên (các chất tương tự tryptophan và phenylalanine) trong một tầng một chậu. Các dây chằng này có một túi điện di hẹp, được chôn sâu, chấp nhận các axit amin đơn lẻ làm chất điện di (chất nền đầu C) nhưng có thể chứa các peptide dài hơn dưới dạng N-nucleophile. Tính chọn lọc này làm cho chúng trở nên lý tưởng cho việc lắp ráp peptide tuần tự, không có nhóm bảo vệ từ đầu C đến đầu N. ATP tiêu thụ được tái chế bằng cách sử dụng polyphosphate kinase (FbPPKWT) với hexametaphosphate rẻ tiền làm chất cho phốt phát.

Quá trình macrolactam chọn lọc vùng esterase (RsEstEng) được thiết kế

- esterase được thiết kế (RsEstEng) xúc tác quá trình macrolactam chọn lọc vùng để tạo thành đoạn phía Bắc (năng suất 73%, cân 52 kg). RsEstEng có nguồn gốc từ carboxylesterase kiểu hoang dã (RsEst) được xác định từ Roseibacillus sp. Chức năng tự nhiên của nó là thủy phân các liên kết este. Thông qua quá trình tiến hóa có định hướng, các nhà nghiên cứu đã chuyển đổi nó thành chất xúc tác cho quá trình macrolactam chọn lọc theo khu vực – sự hình thành liên kết amide macrocycle – trong quá trình tổng hợp đoạn phía Bắc (4) của enlicitide. Nó chấp nhận este tert-butyl ổn định, cồng kềnh của tetrapeptide tuyến tính (9) làm chất cho acyl để tạo ra peptide vĩ mô (4) nhằm tạo thành liên kết amide nội phân tử. Nó đạt được chu trình chọn lọc mà không phát hiện được oligome nào và chỉ có 0,8% sản phẩm phụ thủy phân este, ngay cả trong điều kiện cường độ ion cao từ dòng enzyme trước đó.

Thắt liên phân tử thioesterase (BlTEEng) được thiết kế

- Thioesterase được thiết kế (BlTEEng) thực hiện việc nối liên phân tử các đoạn phía Bắc (4) và phía Đông (3) mà không cần epime hóa. BlTEEng là phiên bản sửa đổi của miền thioesterase (TE) ban đầu được tách ra từ peptide synthetase phi lợi nhuận (NRPS) của Brevibacillus Laterosporus (BlTE). Các thioesterase kiểu hoang dã trong các hệ thống NRPS thường xúc tác cho quá trình vòng hóa vĩ mô hoặc giải phóng các peptide tuyến tính từ protein vận chuyển thông qua liên kết thioester. Các biến thể được thiết kế của BlTE cho thấy một số hoạt động nhưng thiên về sản phẩm phụ dimeric. Kỹ thuật enzyme đã chuyển enzyme này sang xúc tác cho quá trình thắt liên phân tử bằng cách sử dụng các oxoester isopropyl ổn định hơn thay vì các thioester tự nhiên, không bền khi thủy phân.

Quá trình macrocyclization amin khử theo tầng bốn enzyme

- Dòng bốn enzyme (PsIREDEng, KsKREDEng và enzyme tái chế đồng yếu tố StLDHWT, TvADHWT) đạt được quá trình macrocycl hóa amin hóa khử để tạo thành diamine hai vòng (hiệu suất 69%, cân 46 kg). KsKREDEng là một ketoreductase được thiết kế từ Kyrpidia sp. Nó xúc tác quá trình oxy hóa hợp chất rượu benzylic (10) thành aldehyd tạm thời (11) phụ thuộc vào NAD+. PsIRED là một imine reductase từ Pseudogymnoascus sp. Nó phụ thuộc vào NADPH. PsIREDEng xúc tác quá trình amin hóa khử của aldehyd (11) và amin hiện có để tạo thành imine tuần hoàn (12), sau đó khử thành vòng lặp amin thứ cấp (13). StLDHWT tái tạo NAD+ cho bước oxy hóa bằng cách khử pyruvate thành lactate, trong khi TvADHWT tái tạo NADPH cho bước khử bằng cách oxy hóa isopropanol thành axeton.

Quá trình macrocyclization cuối cùng thông qua PBP thioesterase được thiết kế

- Liên kết hóa học với đoạn Western (2), sau đó là thioesterase protein gắn penicillin (SsPBP-TEEng) được thiết kế để khép lại chu trình lớn cuối cùng ở nồng độ cao (70 g/L) – khắc phục giới hạn pha loãng điển hình (5 g/L trong tổng hợp truyền thống). Quy trình tổng thể bao gồm ba bước xếp tầng, 7 enzyme được thiết kế + 3 enzyme phụ trợ, hiệu suất tổng thể 39%, trình diễn ở quy mô nhiều kilôgam, độ tinh khiết >99%, không sắc ký và không có nhóm bảo vệ. Công việc này cung cấp một kế hoạch chi tiết bền vững, có thể mở rộng để sản xuất các peptide vòng lớn phức tạp, giảm đáng kể số bước và lãng phí đồng thời cải thiện hiệu quả và khả năng tiếp cận bệnh nhân.