Các peptide tự nhiên là những “chìa khóa phân tử” tuyệt vời - chúng có ái lực cao, tính chọn lọc tốt và độc tính thấp. Tuy nhiên, chúng vốn có 3 điểm yếu lớn: dễ bị protease cắt nhỏ, khó xuyên qua màng tế bào và tồn tại trong cơ thể quá ngắn. Trong ba thập kỷ qua, các chuyên gia dược phẩm đã giải quyết một cách có hệ thống những thiếu sót này bằng "hộp công cụ gồm các axit amin đặc biệt". Bài viết này sử dụng ngôn ngữ đơn giản và một số lượng lớn biểu đồ để hướng dẫn các đồng nghiệp R&D của CMC phân tách và hiểu hộp công cụ này từ nguyên tắc đến cách thực hiện.
I. Tại sao peptide tự nhiên lại “không đủ”
II. Tổng quan về năm chiến lược sửa đổi chính
III. N-methyl hóa
IV. α-Methyl hóa và Aib
V. Axit amin cấu hình D
VI. Axit amin không tự nhiên
VII. Trường hợp toàn diện: Peptide uống được sản xuất như thế nào
VIII. Trang tham khảo nhanh dành cho các đồng nghiệp của CMC
IX. Xu hướng thiết kế tương lai: AI và công nghệ hiển thị
Việc sử dụng trực tiếp một polypeptide tự nhiên (bao gồm toàn bộ 20 axit amin loại L) làm thuốc thường không kéo dài quá vài phút. Lý do có thể tóm tắt trong một câu: Hệ thống trao đổi chất của con người vốn dĩ được thiết kế để nhận biết và phá vỡ cấu trúc này. Nó được biểu hiện cụ thể bằng bốn câu hỏi liên quan đến nhau.
①Phân hủy protease - Huyết tương, gan, thận và đường tiêu hóa nguy hiểm nhất chứa đầy peptidase/protease (như DPP-4, aminopeptidase, carboxypeptidase, trypsin, v.v.), đặc biệt nhận biết các liên kết amide loại L và thủy phân chúng. Thời gian bán hủy của GLP-1 tự nhiên trong cơ thể chỉ khoảng 1,5 đến 2 phút.
②Tính thấm của màng kém và khó uống: Lượng lớn amide N-H trên khung polypeptide là chất cho liên kết hydro mạnh và bị các phân tử nước bao bọc chặt chẽ, khiến việc đi qua lõi kỵ nước của màng tế bào trở nên khó khăn. Đây là lý do cơ bản tại sao phần lớn peptide chỉ có thể được sử dụng bằng cách tiêm.
③Với thời gian bán hủy ngắn và độ thanh thải qua thận nhanh chóng, các polypeptide trọng lượng phân tử nhỏ (<5 kDa) nhanh chóng được lọc và loại bỏ bởi cầu thận. Cùng với quá trình thủy phân bằng enzyme, mức độ phơi nhiễm trong cơ thể khó duy trì và cần phải sử dụng thường xuyên.
④Các polypeptide tuyến tính có hình dạng linh hoạt và độ chọn lọc kém giống như "mì mềm" trong dung dịch, với vô số hình dạng bị đảo lộn nhanh chóng. Khi liên kết với mục tiêu, tổn thất entropy lớn, ái lực bị giảm và nó cũng có thể liên kết nhầm với nhiều thụ thể liên quan, dẫn đến lệch mục tiêu.
Chiến lược "axit amin đặc biệt" về cơ bản là sửa chữa chính xác bốn điểm yếu này: không làm gián đoạn cấu trúc dược lực học, nó điều chỉnh bộ xương và chuỗi bên, cho phép phân tử "tránh" sự nhận biết của enzyme, "loại bỏ" các liên kết hydro dư thừa và "khóa" cấu hình hoạt động, đồng thời duy trì sự liên kết càng nhiều với mục tiêu càng tốt.
Đầu tiên, sử dụng bảng để thiết lập sự hiểu biết tổng thể. Năm loại sửa đổi sau đây là các phương pháp "axit amin đặc biệt" được sử dụng phổ biến nhất trong thiết kế thuốc peptide hiện đại và chúng sẽ được trình bày chi tiết từng cái một trong các chương tiếp theo.
N-methyl hóa là quá trình thay thế hydro (n-H) trên nguyên tử nitơ của liên kết amit khung xương bằng nhóm metyl (n-CH₃). Một thay đổi tưởng chừng như nhỏ có thể đồng thời kích hoạt bốn thông số chính của dược động học. Cơ chế hoạt động của nó có thể được chia thành ba cấp độ.
Mỗi N-H là một chất cho liên kết hydro mạnh, "gắn" phân tử vào pha nước. Quá trình N-methyl hóa xóa chất cho này làm giảm diện tích bề mặt phân cực (PSA) của phân tử, cho phép phân tử "khử nước" và đi vào lõi kỵ nước của màng. Tác dụng của quá trình N-methyl hóa ở nhiều vị trí có thể được chồng lên nhau - chất tương tự somatostatin Veber-Hirschmann cổ điển, sau khi N-methyl hóa ở ba vị trí, có sinh khả dụng đường uống khoảng 10%.
Nhóm methyl chiếm không gian gần liên kết amit. Túi hoạt động protease không thể “cắn” liên kết cắt một cách chính xác, do đó tăng cường đáng kể sự ổn định trao đổi chất. Đây là cơ sở vật lý mà trên đó quá trình N-methyl hóa có liên quan trực tiếp đến khả năng chống lại quá trình thủy phân bằng enzyme.
Các liên kết amit thông thường hầu hết đều là trans (trans), trong khi quá trình N-methyl hóa mang lại sự khác biệt về năng lượng giữa cis (cis) gần hơn, giúp việc chuyển đổi giữa các cấu hình cis-trans dễ dàng hơn. Bằng cách đó, các nhà thiết kế có thể "cảm ứng" các phân tử gấp lại thành những dạng phù hợp hoạt động cụ thể hoặc hình thành các liên kết hydro nội phân tử để che giấu các nhóm cực (tạo điều kiện thuận lợi hơn nữa cho sự thâm nhập).
Thuốc ức chế miễn dịch này là sách giáo khoa về "hoạt động hiệp đồng của các axit amin đặc biệt". Nó là một peptide tuần hoàn 11 dư chứa 7 N-methyl hóa xương và một D-alanine. Chính quá trình N-methyl hóa và chu kỳ hóa dày đặc này cho phép nó duy trì hoạt động trong miệng trong khi có độ ổn định trao đổi chất cực kỳ mạnh mẽ - nó có thể "chuyển quần áo" giữa dung dịch nước và môi trường màng, hình thành các liên kết hydro nội phân tử để che giấu cực tính và đi qua màng, sau đó mở ra để liên kết với mục tiêu trong pha nước. Do đó, Cyclosporine đã trở thành một trong số ít nguồn peptide vĩ mô "ngoài Quy tắc Năm" tự nhiên có thể được hấp thụ qua đường uống.
Axit amin N-methyl hóa là các amin thứ cấp cản trở không gian với hiệu suất ghép nối thấp, phản ứng chậm và rất dễ bị phân biệt chủng tộc và cắt ngắn diketopiperazine (DKP). Cần có thuốc thử ghép nối mạnh hơn (như phụ gia HATU/COMU +), thời gian ghép kéo dài hoặc ghép đôi, kiểm soát nhiệt độ nghiêm ngặt và giám sát trực tuyến từng bước. Lựa chọn vị trí rất nhạy cảm: Quá trình methyl hóa N ở các vị trí khác nhau trong cùng một trình tự có thể có tác động rất khác nhau đến hoạt động và sự xâm nhập, do đó cần phải sàng lọc từng vị trí.
N-methyl hóa liên quan đến hydro trên nguyên tử nitơ. Quá trình methyl hóa α liên quan đến hydro trên α-carbon. Khi hydro ban đầu trên α-carbon được thay thế bằng nhóm methyl, thì α-carbon thay đổi từ “ba thế” thành “carbon bậc bốn được thế bốn” (ví dụ điển hình nhất là Aib, axit 2-aminoisobutyric, tương đương với việc thêm một nhóm methyl khác vào α-carbon của alanine và đối xứng ở cả hai phía). Điều này mang lại hiệu ứng gấp ba.
Khóa hình dạng (cốt lõi nhất)
Antiprotease
Loại bỏ điểm yếu chirus
GLP-1 tự nhiên được DPP-4 cắt chính xác khỏi vị trí thứ 8 của đầu N, với thời gian bán hủy chỉ từ 1,5 đến 2 phút. Động thái chính của semaglutide là thay thế alanine (Ala8) ở vị trí thứ 8 bằng Aib (α,α-dissubstituted) - sự cản trở không gian của carbon bậc bốn khiến DPP-4 "không thể cắn" vị trí này, do đó ngăn chặn con đường thoái hóa chính từ nguồn.
Ba sửa đổi liên tiếp đã kéo dài thời gian bán hủy từ vài phút lên một tuần:
① Aib8 có khả năng cắt DPP-4;
② Sự thay thế Arg34 tránh được sự xuống cấp ở một vị trí khác và có lợi cho quá trình lipid hóa ở một vị trí cụ thể.
③ Diaxit béo chuỗi dài Lys26 (C18 diaxit + chất liên kết) liên kết thuận nghịch với albumin huyết thanh và trốn tránh sự thanh thải của thận.
Kết quả toàn diện: Thời gian bán hủy khoảng 165 giờ (khoảng 1 tuần) và có thể dùng mỗi tuần một lần.
Aib cũng là một axit amin cản trở không gian, có khả năng ghép chậm. Các axit amin theo sau Aib-aib hoặc AIB thường yêu cầu ghép đôi hoặc kích hoạt mạnh. Điều đáng chú ý là trạng thái “không tự nhiên” của Aib gây trở ngại cho quá trình lên men tái tổ hợp (ribosome không nhận ra nó). Do đó, các peptide có chứa Aib như Simaglutide thường dựa vào chiến lược tổng hợp pha rắn (SPPS) hoặc chiến lược lai pha rắn + lên men và được kết hợp với sự biến đổi cụ thể của chuỗi bên axit béo. Độ phức tạp của quy trình và kiểm soát chất lượng cao hơn đáng kể so với peptide tái tổ hợp thông thường.
Túi hoạt động của protease là một "găng tay" được thiết kế riêng cho cơ chất L. Khi các axit D-amino được thay thế gần liên kết phân cắt, mối quan hệ hình học giữa nhóm carbonyl của cơ chất và bộ ba được xúc tác bởi enzyme bị phá vỡ. Liên kết phân tách không thể được đặt ở vị trí phản ứng chính xác, ái lực liên kết giảm mạnh và do đó quá trình thủy phân dừng lại.
Đảo ngược toàn bộ trình tự trong khi thay thế từng phần dư bằng phần dư hình chữ D. Điều kỳ diệu nằm ở chỗ sự sắp xếp tương đối của các chuỗi bên trong không gian phần lớn được giữ lại, do đó duy trì được hoạt động ban đầu. Tuy nhiên, bộ xương hoàn toàn D, miễn dịch hoàn toàn với protease và khả năng miễn dịch giảm đáng kể. Đây là một công cụ mạnh mẽ để thiết kế các peptide đưa đón hàng rào máu não và các peptide tác dụng kéo dài.
Giá nguyên liệu của axit D-amino thường cao hơn loại L và có ít nhà cung cấp hơn. Cần chú ý đến việc kiểm soát độ tinh khiết bất đối (giá trị ee) và tạp chất đối quang.
Ngoài các sửa đổi cấp độ khung xương nêu trên, các chuyên gia dược phẩm còn có hàng trăm khối xây dựng axit amin phi tự nhiên "được bảo vệ tốt và kích hoạt tốt" đã được thương mại hóa để lựa chọn. Chúng giống như Lego, được lắp ráp thành các chuỗi theo chức năng.
"Các axit amin đặc biệt" giải quyết sự ổn định và hình dạng phân tử. Để biến polypeptide thành thuốc uống, thực tế có hai con đường độc lập nhưng được áp dụng chồng lên nhau để “đi vào”.
Giai đoạn đầu tiên: Sống sót. Các axit amin đặc biệt (Aib, N-methylated, loại D) chống lại sự phân hủy của protease đường tiêu hóa.
① Thẩm thấu phân tử nội tại: Quá trình methyl hóa N làm giảm liên kết hydro /PSA, quá trình tạo vòng + chuỗi bên kỵ nước thúc đẩy liên kết hydro nội phân tử và sự gấp nếp "tắc kè hoa".
② Thúc đẩy quá trình thẩm thấu chuẩn bị: SNAC, natri decanoate và TPE tạm thời mở/vượt qua hàng rào biểu mô ruột.
Giai đoạn thứ ba: Giữ lại cấu trúc albumin/tác dụng kéo dài liên kết chuỗi bên axit béo để duy trì lượng thuốc tiếp xúc với máu.
Các phân tử trong tương lai sẽ ngày càng chứa nhiều axit amin phi tự nhiên và cấu trúc vòng lớn hơn.
Màn hình mRNA (chẳng hạn như hệ thống RaPID) có thể sàng lọc các thư viện peptide ở quy mô 10¹² - 10¹³ trong một lần.
Khuếch tán RF, AlphaFold đã sửa đổi (chẳng hạn như mã hóa vị trí peptide tuần hoàn của AfCycDesign) và các trình tạo học tăng cường đã có thể thiết kế các peptide tuần hoàn/liên kết lớn ngay từ đầu.
Chuỗi xoắn α khóa liên kết olefin chuỗi bên, sự thay thế liên kết hydro, chất tạo nếp β/γ-amino và kỹ thuật tạo khung ở cấp độ nguyên tử đang dần giải quyết vấn đề truyền thống là nhắm mục tiêu tương tác protein-protein nội bào (PPI).
Việc sử dụng các vị trí liên hợp đặc trưng tại một địa điểm được cung cấp bởi các axit amin phi tự nhiên để gắn độc tố, hạt nhân hoặc huỳnh quang, tạo nên "phiên bản peptide ADC". Đồng thời, công nghệ thúc đẩy thâm nhập bằng miệng ngày càng trưởng thành. "Các axit amin + chế phẩm đặc biệt" sẽ cho phép sử dụng nhiều polypeptide hơn mà ban đầu chỉ tiêm được qua đường uống.
