JACS: Merck đã hợp tác với Huanquan và Conquer Biotech để công khai toàn bộ quy trình tổng hợp cho MK-0616.

01 Bối cảnh và thách thức R&D

1.1 Bối cảnh phát triển thuốc MK-0616

Enlicitide Decanoate (còn được gọi là MK-0616) là chất ức chế macrocycle peptide PCSK9 đường uống được thiết kế hoàn toàn de novo đầu tiên nhằm mục đích giảm cholesterol lipoprotein mật độ thấp (LDL-C) và điều trị bệnh tim mạch xơ vữa động mạch.

Như thể hiện trong hình trên, ngoài MK-0616, các ví dụ kinh điển trong lĩnh vực này còn bao gồm kháng sinh vancomycin (2), tác nhân hóa trị liệu paclitaxel (3) và thuốc chống ung thư eribulin (4). Cấu trúc phức tạp của hợp chất 2 và 3 có nghĩa là quá trình tổng hợp thực tế của chúng vẫn dựa vào phương pháp bán tổng hợp dựa trên các sản phẩm tự nhiên; ngược lại, nhóm Eisai đã tổng hợp được toàn bộ hợp chất 4 qua hơn 60 bước, đánh dấu một cột mốc quan trọng trong quá trình tổng hợp hợp chất polyketide.

Về MK-0616, cấu trúc hóa học của nó rất độc đáo: nó là phân tử đầu tiên được thiết kế hoàn toàn từ đầu (chứ không phải có nguồn gốc từ các nguồn tự nhiên); hơn nữa, vì là chất ức chế PCSK9 đường uống hàng ngày nhằm mục đích điều trị các bệnh tim mạch thay vì ứng dụng trong ung thư hoặc chống nhiễm trùng, nhu cầu toàn cầu của nó sẽ vượt xa nhu cầu về các loại thuốc cải tiến thông thường, đòi hỏi phải sản xuất ở quy mô từ hàng trăm kg đến vài tấn.

1.2   Những thách thức và chiến lược tổng hợp

Độ phức tạp phân tử của MK-0616 đặt ra các yêu cầu nghiêm ngặt về phát triển quy trình.

Đặc điểm cấu trúc: Mặc dù MK-0616 có nguồn gốc từ một peptide vòng lớn được xác định thông qua sàng lọc công nghệ hiển thị mRNA, nhưng nó chứa 6 axit amin không chính tắc (tổng cộng 8 đơn vị axit amin), một vòng lớn 37 thành viên, chuỗi bên muối amoni (10) và một đoạn không phải peptide (13), khiến các kỹ thuật tổng hợp peptide pha rắn thông thường hoàn toàn không hiệu quả, như minh họa dưới đây.

Những thách thức cốt lõi cần giải quyết

1、Độ ổn định của các chất trung gian phân cực (đặc biệt đối với các mảnh muối amoni, trong đó phản ứng phải được kiểm soát trong toàn bộ quá trình)；

2、Tính chọn lọc của việc đóng vòng lớn (yêu cầu tối ưu hóa trình tự lắp ráp giữa 10 khối)；

3、Những thách thức về mở rộng quy mô (tránh tinh chế sắc ký; đảm bảo thông lượng ở quy mô miligam đến kilôgam)；

Vì thế, quyết định quan trọng được đề xuất bởi các nhà nghiên cứu như sau：

1、chia để trị：Ưu tiên xây dựng "Đoạn phía Bắc" (vòng 17 thành viên bao gồm các axit amin không chính tắc ở vị trí 5, 6 và 7) và đơn giản hóa chiến lược phân tách vòng lớn thông qua phân tích tổng hợp lại (ví dụ: bằng cách chọn liên kết amide giữa vị trí 5 và 8).

2、Giới thiệu chuỗi bên thiết bị đầu cuối：Mảnh muối amoni phân cực (10) phải được dành riêng cho bước lắp đặt cuối cùng để tránh những thách thức liên quan đến quá trình tinh chế trung gian.

3、Ứng dụng linh hoạt của axit–phản ứng trung hòa bazơ (RCM)：Chuỗi liên kết n-hexan được hình thành ở vị trí 7–13; phản ứng này thể hiện tính trực giao tuyệt vời và có thể được thực hiện theo nhiều giai đoạn.

Thông qua loạt chiến lược này, các nhà nghiên cứu cuối cùng đã thiết lập được một lộ trình tổng hợp có thể mở rộng, mở đường cho việc đánh giá lâm sàng.02

02 Chiến lược tổng hợp và tối ưu hóa

Thông qua các nghiên cứu phân tích, các nhà nghiên cứu đã thực hiện tối ưu hóa nhiều bước, nhiều thế hệ của đoạn vĩ mô quan trọng (đoạn phía Bắc) và tối ưu hóa việc lắp ráp mảnh phía Nam với sản phẩm cuối cùng.

2.1 Tối ưu đa thế hệ phân khúc miền Bắc:

Thế hệ đầu tiên– 37 lần lặp

Quá trình tổng hợp các axit amin không chính tắc (ví dụ: 3-hydroxyproline) cho thấy hiệu quả thấp vì nó phụ thuộc vào các phản ứng tạo vòng không hiệu quả.—chẳng hạn như sự ngưng tụ Dieckmann—cũng như độ phân giải chirus; hơn nữa, quá trình này đòi hỏi nhiều vòng thao tác nhóm bảo vệ và một số quá trình tinh chế sắc ký, như được minh họa trong hình bên dưới.

Tất cả những yếu tố này hạn chế sự tổng hợp quy mô lớn của các mảnh mục tiêu.

Hệ thống đồng bộ thế hệ thứ hai

Một bước đột phá đã đạt được thông qua xúc tác sinh học: việc đưa ra phương pháp khử xeton (KRED) cho phép khử hiệu quả cao và chọn lọc lập thểβ-hydroxyesters; Ngoài ra, enzyme TrpB được thiết kế đã được sử dụng để tổng hợp tryptophan fluoride, do đó loại bỏ nhu cầu phân giải bất đối. Kết quả là số bước tổng hợp đã giảm và việc sử dụng các nhóm bảo vệ được giảm thiểu, như được minh họa trong hình bên dưới.

Lộ trình tổng hợp này để tối ưu hóa đoạn phía Bắc cũng đã được áp dụng trong phát triển lâm sàng; tuy nhiên, các cơ hội phát sinh từ chiến lược cấu trúc đã tạo ra nhu cầu tối ưu hóa hơn nữa con đường tổng hợp mảnh vỡ.

Đầu tiên, những phát hiện quan trọng liên quan đến ba chất trung gian kết tinh ở giai đoạn cuối cung cấp một điểm quan trọng để kiểm soát độ tinh khiết; do đó, điều cần thiết là phải sửa đổi lộ trình tổng hợp để chặn ba chất trung gian này.

Thứ hai, nên thực hiện quá trình cyclotrimer hóa phản ứng olefin càng muộn càng tốt trong quá trình tổng hợp. Cách tiếp cận này dựa trên việc cân nhắc rằng chất xúc tác ruthenium có thể làm tăng tổng chi phí sản xuất benzothiuramine; do đó thực hiện phản ứng này ở giai đoạn cuối của quy trình tổng hợp có thể giảm đáng kể chi phí.

Do đó, điều này đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc tối ưu hóa phương pháp tiếp cận thế hệ thứ ba.

Hệ thống bước chung thế hệ thứ ba

Thông qua quá trình hydroxyl hóa bằng enzyme, L-proline bị oxy hóa trực tiếp thành 3-hydroxyproline với độ chọn lọc lập thể vượt quá 99:1; các chất trung gian quan trọng đã được xác định, chẳng hạn như độ kết tinh của muối benzensulfonate, giúp tránh được việc tinh chế sắc ký; việc lắp ráp mô-đun đã được sử dụng, cùng với việc điều chỉnh trình tự liên kết axit amin và đơn giản hóa chiến lược nhóm bảo vệ, như được minh họa trong hình bên dưới.

Mảnh tổng hợp MK-0616 Northern thế hệ thứ ba khác với các mảnh được tổng hợp ở hai thế hệ trước. Sự lựa chọn này được thúc đẩy bởi việc xác định pentanoate tinh thể 91, thiếu dư lượng axit amin threonine (sẽ được kết hợp sau trong quá trình tổng hợp). Muối này có thể được phân lập với năng suất và độ tinh khiết cao, đồng thời cung cấp chất trung gian có độ ổn định cao có thể được lưu trữ làm chất trung gian quan trọng trong suốt quá trình tổng hợp.

Thông qua tối ưu hóa ở thế hệ thứ ba, việc tách mảnh phía Bắc được thiết kế mới (91) hiện chỉ cần 14 bước—chỉ bằng một phần ba số bước cần thiết cho quá trình tổng hợp thế hệ đầu tiên. Hơn nữa, điều quan trọng cần lưu ý là trong giao thức thế hệ thứ ba, chuỗi tuyến tính dài nhất đã giảm hơn một nửa, từ 20 bước xuống còn 9 bước.

2.2 Tối ưu hóa đoạn phía Nam

Thế hệ đầu tiên, bao gồm 15 bước

Bắt đầu từ nguyên liệu thô được mua với số lượng lớn từ các nhà cung cấp thương mại, quy trình 9 bước thể hiện chuỗi tuyến tính dài nhất, như thể hiện trong hình bên dưới.

Hệ thống đồng bộ thế hệ thứ hai

Trong quá trình tổng hợp thế hệ thứ hai, điều được cải thiện không phải là số bước mà là hiệu quả tổng thể và khả năng kiểm soát độ tinh khiết, như được minh họa trong sơ đồ bên dưới. Sau hàng ngàn thử nghiệm, một mảnh Southern blot gọi là muối leelamine (99) đã được xác định.

Việc sử dụng hai hợp chất này trước đây đã được chứng minh là có tác dụng làm dung môi không đối kháng cho axit cacboxylic; do đó, muối kết tinh (99) có thể thu được một cách đáng ngạc nhiên dưới dạng một chất có độ tinh khiết cao, do đó tránh được công việc HPLC điều chế rộng rãi cần có trong thế hệ tổng hợp trước đó.

2.3 Lắp ráp sản phẩm cuối cùng

Cả mảnh phía Bắc thế hệ thứ nhất và mảnh trung gian thứ hai của mảnh phía Nam đều có thể được bảo vệ dễ dàng để tạo ra tiền thân tuyến tính 61, như thể hiện trong hình bên dưới; tuy nhiên, hiệu suất tạo ra sản phẩm chuyển hóa cycloolefin rất thấp.

Bất chấp điều đó, các nhà nghiên cứu đã sử dụng thành công một trình tự khác, cho phép tổng hợp MK-0616 có thể mở rộng lần đầu tiên, như được minh họa trong sơ đồ bên dưới.

Muối enaldehyde thế hệ đầu tiên được tổng hợp thông qua quy trình 63 bước bắt đầu bằng việc lắp đặt chuỗi bên vào lõi phân tử thông qua quá trình amit hóa năng suất cao, sau đó là tinh chế SFC; trong số các bước này, bước 28 đại diện cho chuỗi tuyến tính dài nhất.

Sự kết hợp sản phẩm cuối cùng thế hệ thứ hai được thể hiện trong hình bên dưới.

Bằng cách tối ưu hóa các con đường cho cả các mảnh phía Bắc và phía Nam nhắm vào sản phẩm mục tiêu, cả hai phương pháp đều có thể sử dụng các chất trung gian tinh thể mảnh phẳng để tiến tới giai đoạn tổng hợp cuối cùng.

Phản ứng ghép đôi này đủ sạch để tiến hành ngay bước tiếp theo bằng phản ứng thô.

Nhìn chung, lộ trình tổng hợp thế hệ thứ hai cho MK-0616 yêu cầu 43 bước, trong đó 21 bước tạo thành chuỗi tuyến tính dài nhất. Trình tự này làm giảm cả tổng số bước và độ dài của chuỗi tuyến tính dài nhất so với quy trình thế hệ đầu tiên xuống một phần ba.

03 Đổi mới công nghệ then chốt

Phân tích toàn bộ quá trình tối ưu hóa cho thấy một số đổi mới trong các công nghệ chính, chẳng hạn như:

1、Công nghệ xúc tác sinh học:Độ phân giải động học KRED; Tổng hợp các chất tương tự tryptophan qua trung gian enzyme TrpB; đưa trực tiếp các nhóm hydroxyl qua proline hydroxylase; vân vân.

2. Thanh lọc theo hướng kết tinh: Nhiều bước trung gian—chẳng hạn như methylsulfonate của các mảnh Northern blot hoặc muối leelamine của các mảnh Southern blot—được sử dụng để đạt được quá trình tinh chế kết tinh, do đó loại bỏ sự cần thiết của cột sắc ký.

3. Chiến lược nhóm bảo vệ trực giao: chuyển đổi linh hoạt giữa các nhóm bảo vệ như Boc và Nosyl để đảm bảo tính chọn lọc của các phản ứng nhiều bước.

4. Những cân nhắc về hóa học xanh: giảm việc sử dụng chất xúc tác kim loại nặng (ví dụ: chất xúc tác ruthenium) và chuyển phản ứng RCM sang giai đoạn sau để giảm chi phí sản xuất.

04 Tóm tắt và Triển vọng
Bài viết này thể hiện sự tích hợp linh hoạt giữa xúc tác sinh học và tổng hợp hóa học, đồng thời nhấn mạnh vai trò then chốt của quá trình kết tinh và áp dụng phương pháp thiết kế mô-đun, qua đó trình bày một phương pháp có hệ thống trải dài từ thăm dò trong phòng thí nghiệm đến sản xuất ở quy mô công nghiệp. Công trình này đại diện cho một trường hợp mẫu mực trong lĩnh vực tổng hợp phân tử phức tạp: tổng số bước đã giảm từ 63 trong giao thức thế hệ thứ nhất xuống còn 43 trong giao thức thế hệ thứ hai, với năng suất tăng gần 1.000 lần và cho phép tính khả thi của sản xuất quy mô tấn. Trong toàn bộ quá trình, chiến lược nhấn mạnh vào bước kết tinh, do đó tránh được việc tinh chế sắc ký—một tính năng khiến nó rất phù hợp cho sản xuất quy mô tấn. Hơn nữa, nghiên cứu này cung cấp một khuôn mẫu kỹ thuật cho các phương pháp tổng hợp đối với các peptide vòng lớn phức tạp khác.